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  • 鉴定资讯
  • 2024-05-15 14:32:55

基因检测中一代与二代测序的区别

基因检测一代与二代测序的区别

  主要是区别于测序原理,通量和成本以及读长。一代测序是sanger法。核酸链是由dNTP3号位的羟基和5号位的磷酸缩合形成磷酸二酯键连在一起的,如果把三号位的羟基上的氧去掉,反应就不能发生了。

  那么,我们在反应底物中以一定比例dNTP中掺入这种脱掉氧的ddNTP,并在不同的ddNTP上带上不同的放射性同位素,在进行PCR的时候就会发生随机的链中止反应。

  举个例子,以1%的浓度掺入带某种黄色荧光ddCTP,那么当测序到第一个C的时候,就会有1%的产物在这里中止,带上黄色荧光剩下的99%的产物继续往下面PCR,直到PCR进行到需要下一个C的时候又重复上一个过程,其他碱基一样,带个不同的荧光信号就可以了。然后跑个毛细管电泳,检测荧光信号,读出序列条带,大致原理就是这样。

  从原理上看,因为最终检测是电泳,太小和太长的片段都分辨不出来,所以测序准确的范围一般认为是在80-800,同时一次只能测一个条带,两个条带图谱会乱(同一个位置检测到两种不同的光信号),但结果相对准确。与二代相比,对于大序列的测定,时间长,成本高,想当年人类基因组计划,几个国家愣是靠一代测序怼了接近15年,预算30亿美金。

  科研服务领域主流是二代和三代测序,在应用领域则是芯片和多重PCR比较多。而二代测序因为平台的不同,其具体的测序原理会不同,但大的原理相似。

  先是把你的基因组或者cDNA序列打成小的片段,再在你的这些小的片段的两端加上特定的接头序列,之后通过(与接头序列)碱基互补配对,将这些小片段固定再许多的通道上(可以理解为把小片段固定在了很多的独立的小孔里)。然后进行预PCR,先跑几轮正常的PCR增加产物以放大后续的信号。再进行类似于sanger的链终止PCR,然后收集荧光信号(现在也有测量加入了DNTP后ph变化的),再对收集到的荧光信号进行处理,拼接,得到基因组或是转录组序列。

  二代测序平台不同,优劣也略有区别,但相对于一代测序,一般认为其准确性略有降低,读长短(一次测个2,3百)遇到一些重复序列拼接起来很难。但人家通量高,时间短,对于基因组序列这些来说单个碱基成本便宜了许多。二代测序与一代测序互为补充,并不存在竞争与替代关系。虽然一代测序读长比较长,但是因为通量和成本的关系,目前基本一代测序已经被淘汰了。

  一代测序序列短,并且不能提高通量,所以对于大片段或者全外显子等非常耗时,成本还高。二代测序又成新一代测序,主要特点是通量大,测序速度快,能够满足当前测序的几乎全部需要。成为现在发展最快的测序技术。

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